В рамках вводной лекционной части мы рассмотрим применение редактирования геномов для изучения функции генов и регуляторных элементов генома, создания репортёрных клеточных линий и линий-продуцентов белков, моделирования генетически-обусловленных заболеваний человека и улучшения свойств животных.

Мы познакомимся с историей систем редактирования геномов. Рассмотрим случайные вставки в геном с помощью лентивирусов и транспозонов. Обсудим методы направленного разрезания генома (нуклеазы с цинковыми пальцами, TALEN, CRISPR/Cas9) и направленные  вставки в геном с помощью гомологичной рекомбинации. Для каждого из методов проанализируем преимущества и ограничения, а также отдельно рассмотрим модификации системы CRISPR/Cas9 и сложные генетические системы, такие как Cre/lox и дегроны.

Мы рассмотрим возможности применения системы CRISPR/Cas9 для инактивации гена интереса, замены одного или нескольких кодонов, внесения небольших аффинных меток. Проанализируем особенности выбора места редактирования гена, проведём дизайн гидовых РНК и матриц для гомологичной рекомбинации, подберём праймеры для генотипирования. Обсудим подходы к предварительному скринингу наличия вносимых замен в моноклональных клеточных линиях.

В рамках практической части рассмотрим стратегию клонирования и получим необходимые для редактирования генетические конструкции. Проведём трансфекцию и познакомимся со способами селекции трансфецированных клеток. Рассмотрим различные подходы к рассеву клеточных линий на моноклоны (с помощью клеточного сортера и вручную) и стратегией их культивирования.

Далее проведём генотипирование моноклональных клеточных линий с отредактированным геномом, обсудим возможные трудности интерпретации результатов секвенирования. Подтвердим инактивацию гена с помощью вестерн-блоттинга.

В данном разделе мы обсудим различные типы вирусных векторов, применяемых для редактирования генома клеток млекопитающих, их преимущества и недостатки. Рассмотрим, для каких научных задач используются вирусные частицы. Разберёмся, какие элементы содержат плазмидные конструкции, используемые для получения вирусов.

В рамках практической части мы научимся получать лентивирусы, несущие гидовые РНК и флуоресцентную метку, начиная с создания плазмид. Оценим эффективность трансдукции клеточной линии полученными вирусами с помощью проточного цитофлуориметра. Познакомимся с принципами работы с флуоресцентными репортёрами, полученными с использованием лентивирусов.

В теоретической части раздела мы рассмотрим используемые в геномном редактировании транспозонные системы и системы индуцибельной суперэкспрессии гена интереса. Обсудим области применения аффинных меток, как их правильно подбирать и какие существуют стратегии клонирования тагированных белков.

В практической части раздела мы клонируем плазмиду для интеграции транспозона с HA-тагированным белком. Проведём трансфекцию, пуромициновую селекцию клеток с целевой вставкой для получения поликлональной клеточной линии и индуцируем в ней суперэкспрессию. В завершение количественно оценим экспрессию тагированного белка с помощью ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга.

Мы познакомимся с теоретическими аспектами планирования экспериментов по созданию лабораторных мышей с отредактированным геномом, принципами разведения и содержания линий.

Рассмотрим отличия между генетическими конструкциями для редактирования генома клеточных линий и мышей с помощью системы CRISPR/Cas9. Получим гидовые РНК с помощью in vitro транскрипции и подготовим смесь для микроинъекции с мРНК Cas9.

Сходим на экскурсию в виварий, познакомимся с его устройством. Понаблюдаем за процессом микроинъекции компонентов систем геномного редактирования в оплодотворённую яйцеклетку мыши и подсадкой эмбриона суррогатной матери.

В рамках семинарских занятий мы постараемся ответить на интересующие вас вопросы, касающиеся применения редактирования генома клеточных линий млекопитающих и мышей.